מעבר אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

דיאגרמת יבלונסקי של FRET עם ציון סקאלות הזמנים.

מעבר אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית או FRET (באנגלית: Fluorescence Resonance Energy Transfer או Förster Resonance Energy Transfer) הוא תופעה פיזיקלית המתארת מעבר אנרגיה בין 2 מולקולות רגישות לאור (כרומופורים).

בתהליך זה, הכרומופור התורם (donor), מעורר על ידי בליעת אור (פוטון) לרמת אנרגיה גבוהה יותר, אך אינו פולט אור. במקום זאת, מתקיים מעבר אנרגיה באמצעות צימוד דיפול דיפול אל רמת העירור בכרומופור המקבל (acceptor). כתוצאה מכך, המקבל פולט אור (פלואורסצנציה).

היעילות של העברת אנרגיה זו עומדת ביחס הפוך לחזקה ה-6 של המרחק בין התורם למקבל, מה שהופך את FRET לתהליך רגיש מאוד לשינויים קטנים במרחק.

מנגנון זה הוא הבסיס לספקטרוסקופיית FRET המשמשת בביופיזיקה למדידת מרחקים בבמערכות ביולוגיות בסקאלה של ננומטרים בודדים (דוגמת חלבונים וחומר תורשתי).

התופעה קרויה על שם תאודור פורסטר (Theodor Förster), מדען גרמני שהצליח לתאר אותה כמותית ולקשר את המנגנון לגדלים מדידים, החל משנות ה-40 של המאה ה-20, בד בבד עם התבססות מכניקת הקוונטים.

קיימת אנלוגיה בין FRET לבין תקשורת בשדה קרוב, בכך שרדיוס האינטראקציה הרבה יותר קטן מאורך הגל של האור הנפלט. באזור השדה הקרוב, הכרומופור המעורר פולט פוטון וירטואלי הנבלע באופן מיידי על ידי הכרומופור המקבל. מאחר שחוקי שימור האנרגיה והתנע לא מתקיימים עבורו, הפוטון הווירטואלי לא ניתן לגילוי ולכן FRET הוא מנגנון לא-קרינתי. חישובים שנעשו במסגרת אלקטרודינמיקה קוונטית כי מעבר לא-קרינתי (FRET) ומעבר קרינתי הם למעשה 2 אסימפטוטות, קצרת-טווח וארוכת טווח בהתאמה, של אותו מכניזם.

טרמינולוגיה

התופעה קרויה על שם המדען הגרמני תאודור פורסטר. כאשר 2 הכרומופורים הם גם פלואורפורים נעשה שימוש במקום זאת במונח מעבר אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית,(fluorescence resonance energy transfer), על אף שמעבר האנרגיה אינו פלואורסצנטי. כמו כן התהליך יכול להתרחש גם בין 2 פוספורים.

רקע תאורטי

הקונספט של FRET.

הסבר פיזיקלי

מבחינה כמותית, אפשר לתאר את המולקולה התורמת (שהיא נייטרלית חשמלית) כדיפול חשמלי בעל וקטור דיפול  ${\vec {p}}_{d}$ המתנדנד בתדר $\omega$ לאור הימצאותו בשדה חשמלי חיצוני, שהוא מקור האור בניסוי. המולקולה המתנדנדת מייצרת שדה חשמלי של דיפול, ובתחום השדה הקרוב בו המרחק $r$ קטן בהרבה מאורך גל האור $r\ll \lambda$ השדה החשמלי הוא בקירוב:

$${\vec {E}}_{d}({\vec {r}})\approx {\frac {3({\hat {r}}\cdot {\vec {p}}_{d}){\hat {r}}-{\vec {p}}_{d}}{n^{2}r^{3}}}$$

כאשר $n$ הוא מקדם השבירה בחומר ו-${\vec {r}}$ וקטור המיקום בו נמדד השדה החשמלי. שדה קרוב זה נבלע במולקולה המקבלת בהספק אנרגטי  $P$ שהוא הממוצע בזמן של מכפלת השדה בנגזרת הזמנית של מומנט הדיפול של המולקולה המקבלת, ${\vec {p}}_{a}$ :

$$P={\big \langle }{\vec {E}}\cdot {\frac {d{\vec {p}}_{a}}{dt}}{\big \rangle }$$

ההספק מחולק באנרגיה של פוטון לקבל קצב בליעת פוטונים  $\kappa _{FRET}$ והוא פרופורציוני לגורם גאומטרי $k^{2}$, לאינטגרל החפיפה $J$  ותלוי במרחק:

$$\kappa _{FRET}\propto {\frac {k^{2}J}{r^{6}}}\equiv {\frac {1}{\tau _{0}}}{\bigg (}{\frac {R_{0}}{r}}{\bigg )}^{6}$$

כאשר הגדרנו $\tau _{0}$ כזמן הבליעה כאשר המולקולות מרוחקות ביניהן פורסטר. הגורם הגאומטרי $k^{2}$ תלוי בשלוש זוויות: $\theta _{T}$ היא הזווית בין מומנטי הדיפול של המולקולות, $\theta _{a}$ ו-$\theta _{d}$ הן בהתאמה הזוויות בין מומנטי הדיפול של המולקולה התורמת ושל המולקולה המקבלת לציר המחבר בין המולקולות ${\hat {r}}$ :

$$k^{2}=(cos\theta _{T}-3cos\theta _{d}cos\theta _{a})^{2}$$

אינטגרל החפיפה $J$ מתאר את החפיפה בין ספקטרום הפליטה המנורמל של המולקולה התורמת $F_{d}(\lambda )$ לספקטרום הבליעה המולרי של המולקולה המקבלת $\varepsilon _{a}(\lambda )$  בשקלול אורך הגל ברביעית, כתוצאה מהתלות בתדר של אנרגיית קרינת  דיפול חשמלי:

$$J=\int _{0}^{\infty }F_{d}(\lambda )\varepsilon _{a}(\lambda )\lambda ^{4}d\lambda$$

תופעה מקבילה קיימת בפיזיקה אטומית, בה גרעין מעורר מעביר אנרגיה באופן לא קרינתי לאלקטרונים קשורים, במקום לפלוט קרינת גאמא.

יעילות ה-FRET

יעילות ה-FRET, $E$, מוגדרת כיעילות הקוונטית של מעבר האנרגיה, כלומר, היחס בין התדירות שבה מתרחש אירוע העברת אנרגיה לבין התדירות שבה מתרחש אירוע עירור תורם:

$E={\frac {k_{\text{ET}}}{k_{f}+k_{\text{ET}}+\sum {k_{i}}}}$

כאשר $k_{\text{ET}}$ הוא קצב מעבר האנרגיה הלא קרינתית, $k_{f}$ הוא קצב דעיכה קרינתי (פלואורסצנטי) ו-$\sum {k_{i}}$ הוא סכום קצבי כל תהליכי הפליטה האחרים.

חישוב קצב המעבר הלא קרינתי, $k_{\text{ET}}$, כפונקציה של המרחק בין המולקולות ($r$) נעשה כך:

$$k_{ET}\left(r\right)={\frac {1}{\tau _{D}}}\left({\frac {R_{0}}{r}}\right)^{6}$$

כאשר, $\tau _{D}$ הוא זמן החיים של התורם בהיעדר מעבר האנרגיה.

יעילות ה-FRET תלויה בפרמטרים הפיזיקליים הבאים:

• המרחק בין התורם למקבל - בדרך כלל בין 1–10 ננומטר.
• החפיפה הספקטרלית בין ספקטרום הפליטה של התורם לספקטרום הבליעה של המקבל.
• האוריינטציה היחסית בין מומנט הדיפול של התורם למומנט הדיפול של המקבל.

יעילות ה-FRET, $E$, תלויה במרחק בין שתי המולקולות ($r$) באופן הבא:

$$E={\frac {R_{0}^{6}}{r^{6}+R_{0}^{6}}}$$

כאשר $R_{0}$, אורך פורסטר, הוא המרחק בו היעילות היא 50% והוא תלוי במידת החפיפה בין ספקטרום הפליטה של המולקולה התורמת לספקטרום הבליעה של המולקולה המקבלת, ובזווית בין שתי המולקולות.

ניתן להתאים את $R_{0}$ לצורכי הניסוי, והוא נע לרוב בן ננומטרים בודדים לעשרות ננומטרים. מכיוון שהיעילות תלויה בחזקה השישית של המרחק, העקומה משתנה מהר בסביבות $R_{0}$ ומאפשרת מדידה מדויקת של מרחק.

שיטות מדידה ליעילות ה-FRET

מדידת זמן חיים פלואורסצנטי

ניתן לקבוע את יעילות ה-FRET, $E$, על ידי מדידת השינוי בזמן החיים הפלואורסצנטי של התורם כתוצאה מנוכחות המקבל:

$$E=1-{\frac {\tau _{\text{D}}^{A}}{\tau _{\text{D}}}}$$

כאשר, $\tau _{D}^{A}$ ו-$\tau _{D}$ הם זמני החיים של התורם בנוכחות ובהיעדר המקבל בהתאמה. עקב נוכחות המקבל, זמן החיים של התורם מתקצר ולכן יעילות ה-FRET, $E$, תמיד תהיה קטנה או שווה ל-1. מדידות אלו משמשות בדימות מיקרוסקופי מבוסס זמן חיים פלואורסצנטי (FLIM ).

מדידת קיטוב פלואורסצנטי

השיטה מתבססת על היחס הקיים בין בין זמן החיים של התורם לבין הקיטוב - כאשר הקיטוב עולה זמן החיים מתקצר.

ע"פ נוסחת פרין , היחס בין הקיטוב הפלואורוסצנטי $(P)$ לבין זמן החיים הפלואורסצנטי $(\tau _{F})$ מבוטא בצורה הבאה:

$${\frac {1}{P}}-{\frac {1}{3}}=\left({\frac {1}{P_{0}}}-{\frac {1}{3}}\right)\left(1+{\frac {\tau _{F}RT}{\eta V}}\right)$$

כאשר $V$ הוא הנפח המולרי של הפלואורפור המסתובב, $R$ הוא קבוע הגזים, $T$ היא הטמפרטורה ו-$\eta$ היא צמיגות התווך. $\left({RT}/{\eta V}\right)^{-1}$ מוגדר כזמן קורלציה סיבובי,$\tau _{R}$. $P_{0}$ הוא הקיטוב האינהרנטי כאשר $T/\eta \longrightarrow 0$.

זמן החיים של התורם בהיעדר המקבל:

$$\tau _{D}=\tau _{R}{\Biggl (}{\frac {1/P_{D}-1/P_{0}}{1/P_{0}-{\frac {1}{3}}}}{\biggr )}$$

זמן החיים של התורם בנוכחות המקבל:

$$\tau _{D}^{A}=\tau _{R}{\Biggl (}{\frac {1/P_{D}^{A}-1/P_{0}}{1/P_{0}-{\frac {1}{3}}}}{\biggr )}$$

כאשר, $P_{D}^{A}$ ו-$P_{D}$ הן רמות הקיטוב של התורם בנוכחות ובהיעדר המקבל בהתאמה.

בנוסף, יעילות ה-FRET, $E$, נמדדת על ידי זמן החיים הפלואורסצנטי בצורה הבאה:

$$E=1-{\frac {\tau _{\text{D}}^{A}}{\tau _{\text{D}}}}$$

לכן, ניתן למדוד ישירות את יעילות ה-FRET באמצעות הקיטוב הפלאורסצנטי:

$$E=1-{\frac {P_{0}\left(P_{D}^{A}-P_{D}\right)}{P_{D}^{A}\left(P_{0}-P_{D}\right)}}$$

רגישות פליטה

השיטה מתבססת על מדידת השינויים בעוצמת הפליטה של המקבל. כאשר התורם והמקבל קרובים האחד לשני (1–10 ננומטר), בשל האינטראקציה של שתי המולקולות, פליטת המקבל תגדל עקב כוח פנים מולקולרי שיוצר ה-FRET בין התורם למקבל .

כדי לנטר שינויי מבנה בחלבון, חלבון היעד מסומן עם תורם ומקבל בשני אתרי גן. כאשר החלבון מסתובב או מתעקל, נוצר שינוי במרחק או באוריינטציה בין התורם למקבל ומכאן שינוי ביעילות ה-FRET. אם אינטראקציה מולקולרית או שינוי מבנה חלבון תלויים בקשר ליגנד, ניתן להשתמש בטכניקת FRET כיישום של גלאי פלואורסצנטי לזיהוי ליגנד.

ליבון אופטי

השיטה מתבססת על מדידת שיעורי קצב הליבון האופטי (Photobleaching ) של התורם, בהיעדר ובנוכחות המקבל. מאירים באורך גל שיגרום לעירור התורם אך לא המקבל על דגימות עם וללא המקבל ומנטרים את פלואורסצנטיית התורם (פליטת אור באורך גל הפלואורסצנטי) לאורך זמן. ההפרדה מהמקבל נעשית בדרך כלל על ידי מסנן מעביר פס אופטי. סקלת הזמן של הליבון האופטי מבוטאת על ידי הפלואורסצנציה המתקבלת עבור כל דגימה:

$${\text{background}}+{\text{constant}}\cdot e^{-{\text{time}}/\tau _{\text{pb}}}$$

כאשר, $\tau _{\text{pb}}$ הוא קבוע זמן דעיכת הליבון האופטי והוא תלוי בנוכחותו או העדרו של המקבל. מאחר שהליבון האופטי עולה בקנה אחד עם איבטול (inactivation) קבוע של פלואורפורים מעוררים, מעבר האנרגיה בתהודה בין הפלואורפור התורם המעורר לפלואורפור המקבל, מונע את הליבון האופטי של אותו תורם ולכן יעילות FRET גבוהה מובילה לזמן דעיכת ליבון אופטי ארוך יותר:

$$E=1-{\frac {\tau _{\text{pb}}}{\tau _{\text{pb}}^{A}}}$$

כאשר, $\tau _{\text{pb}}$ ו-$\tau _{\text{pb}}^{A}$ הם זמני דעיכת ליבון אופטי של התורם בהיעדר ובנוכחות המקבל בהתאמה. נוסחה זו הפוכה לנוסחת היחס בין זמני החיים הפלאורסצנטיים של התורם בהיעדר ובנוכחות המקבל.

לטכניקה זו אשר הוצגה לראשונה בשנת 1989 יש מספר יתרונות:

• דיוק - עקב היכולת למדוד בנקודות זמן רבות.
• סדר גודל - קבועי הזמן נמדדים ביחידות של שניות לעומת זמן חיים פלואורסצנטי הנמדד ביחידות של ננושניות.

פלואורופורים המשמשים ל-FRET

זוגות CFP-YFP

כאשר החלבונים קשורים, עירור ה-CFP על ידי בליעה באורך גל של 414 ננומטר גורם פליטה של YFP באורך גל של 525 ננומטר עקב FRET. אם הקשר מפורק על ידי הפרוטאז, תהליך ה-FRET מפסיק להתקיים והעירור גורם לפליטת CFP באורך גל של 475 ננומטר.

אחד הזוגות הנפוצים עבור שימוש ביולוגי ב-FRET הוא חלבון פלואורסצנטי כחול-ירקרק ((cyan fluorescent protein (CFP) - חלבון פלואורסצנטי צהוב ((yellow fluorescent protein (YFP). תיוג עם צבענים פלואורסצנטיים אורגניים דורש טיהור, תגובה כימית, זריקה תוך-תאית אל החלבון המארח. לעומת זאת, וריאנטי GFP יכולים להיצמד לחלבון המארח באמצעות הנדסה גנטית. בנוסף, היתוך בין CFP ל-YFP הנקשר באמעות רצף פרוטאז בקיע, יכול לשמש כתבחין ביקוע.

BRET

אחת המגבלות של FRET היא שנדרשת תאורה חיצונית על מנת ליזום את מעבר האנרגיה. תאורה זו יכולה ליצור רעש רקע כתוצאה מעירור ישיר של המקבל או לגרום לליבון אופטי מלא של התורם/המקבל.

כדי למנוע תופעות לוואי אלו, פותחה טכניקה דומה הנקראת מעבר אנרגיה בתהודה ביולומינסנצית או בקיצור BRET. הטכניקה זו משתמשת בלוציפראז ביולומיסנצטי (בדרך כלל בלוציפראז ממושבת צורבים) במקום ה- CFP כדי לייצר פליטת פוטון ראשונית תואמת YFP.

עם זאת, BRET מוגבלת על ידי הדרישה לייצר לפחות היתוך אחד בין חלבון מקודד לבין הלוציפראז, אם כי כמה יישומים של FRET ניתן ליישם עם פלואורפורים מצומדי נוגדנים.

HOMO-FRET

באופן כללי, FRET, מוגדר עבור מצבים שבהם התורם והמקבל הם חלבונים (או פלואורפורים) מסוג שונה. על אף זאת, במערכות ביולוגיות רבות, נדרשים החוקרים לבחון אינטראקציה בין 2 חלבונים מאותו סוג או אינטראקציה בין חלבון לבין עצמו (למשל, אם החלבון יוצר או פורש חלק משרשרת פולימרית של חלבונים) או עבור שאלות כמותיות אחרות בתאים ביולוגיים.

במקרים אלו, לא ניתן למדוד FRET על ידי הבדלים ספקטרליים שכן הן לתורם והן למקבל יש אותם ספקטרומי בליעה ופליטה. על אף פי כן, ניתן למדוד את הקיטוב המשתנה בין בליעה של אור לפליטה של אור על ידי שיטה הנקראת דימות אנאיזוטרופיות FRET (באנגלית: FRET anisotropy imaging).רמת האנאיזוטרופיה מהווה מדד לכמות אירועי ה-FRET שקרו.

שימושים

בכימיה ובביולוגיה, FRET משמש ככלי למדידת מרחק ולזיהוי אינטראקציות מולקולריות:

• מדידת מרחק בין אזורים בתוך חלבון בודד - מידע על קונפורמצית החלבון.
• זיהוי מיקום ואינטראקציות בין גנים ומבנים תאיים כולל אינטגרינים וחלבוני ממברנה.
• קבלת מידע על מסלולים מטבוליים או מעברי אותות.
• קבלת מידע על ליפידים שומניים בקרום התא.

בנוסף, FRET ו-BRET הם כלים נפוצים במחקר של קינטיקה אנזימטית ומנועים מולקולריים.

בספקטרוסקופיה, חלק מטכניקות הריווי הדיכוי הפלואורסצנטי (Quenching) מתבססות על FRET.

בטבע, ניתן למצוא מנגנון העברת אנרגיה דמוי-FRET בתהליך הפוטוסינתזה, בו מערר הפוטון את התורם והאנרגיה מועברת למקבל וממנו הלאה למקבל הבא ולבא אחריו למקבל עד שלבסוף מגיעים למרכז התגובה, שם נתרמים אלקטרונים הלאה. שימוש נוסף בטבע נעשה בהגנת שוניות מקרינת UV.

שיטות אחרות

מנגנון שונה אך קשור הוא מעבר אלקטרון דקסטר (Dexter electron transfer).

שיטה חלופית לזיהוי אינטראקציית חלבון-חלבון היא השלמה פלואורסצנטית ביומולקולרית (Bimolecular fluorescence complementation או בקיצור BiFC) שבו שני חלקים של חלבון פלואורסצנטי מותכים עם חלבונים אחרים. כאשר שני חלקים אלה נפגשים, הם יוצרים פלואורפור בזמן של דקות או שעות.

קישורים חיצוניים

מדיה וקבצים בנושא מעבר אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית בוויקישיתוף

• Forster Resonance Energy Transfer Demonstration Animation באתר יו טיוב
• FRET-Fluorescence Resonance Energy Transfer - 3D Scientific Animation באתר יו טיוב