אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל
אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל (באנגלית: Two-dimensional gel electrophoresis, ובקיצור 2DE או 2D electrophoresis) היא שיטה ביוכימית להפרדה אנליטית של חלבונים באמצעות הרצתם בשדה חשמלי (אלקטרופורזה). החלבונים מופרדים במקביל בשתי שיטות שונות (שני ממדים) על גבי הג'ל.
עקרון ההפרדה
שיטה זו היא למעשה שילוב של שתי שיטות הפרדה אחרות, במקביל. ראשית החלבונים מופרדים בשיטת מיקוד איזואלקטרי (isoelectric focusing) ולאחר מכן מתבצעת הפרדה גם אלקטרופורטית בנוכחות SDS (שיטת SDS-PAGE). בתום ההפרדה החלבונים מופרדים זה מזה גם על פי הבדלי המטען (הנקודה האיזואלקטרית) שלהם וגם בשל הבדלי המשקל.
הפרדה ראשונה: על פי נקודה איזואלקטרית
ערך מורחב – מיקוד איזואלקטרי
ההפרדה הראשונה מתבססת על ההבדלים במטען הכללי של החלבונים השונים כתלות ב-pH של התמיסה בסביבתו. לכל חלבון הרכב חומצות אמינו שונה, ולכן המטען החשמלי של החלבונים שונה זה מזה. הנקודה האיזואלקטרית הינה ערך ההגבה (pH) שבו סך המטען על החלבון שווה לאפס. לכן, זהו ערך ההגבה היחיד בו לחלבון לא תהיה מוביליות בשדה חשמלי.
כדי להפריד את החלבונים על פי הבדלי הנקודות האיזואלקטריות שלהם החלבונים מורצים בשדה חשמלי על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד בעל גרדיאנט pH (ודרגת החומציות של הג'ל משתנה באופן סמי-רציף לאורכו). כל חלבון ינוע לכיוון האלקטרודה המנוגדת לסך מטענו, ויעצר כאשר הוא מגיע לאזור בג'ל בו ה-pH זהה לנקודה האיזואלקטרית של החלבון. בסיום ההרצה החלבונים יופרדו על פי מטענם, אך ההפרדה עדיין אינה ברגישות גבוהה כיוון שחלבונים בעלי משקל מולקולרי שונה אך בעלי נקודות איזואלקטריות זהות לא יופרדו אחרי השלב הראשון.
הפרדה שנייה: על פי מסה
ההפרדה השנייה זהה בתכונותיה לשיטת SDS-PAGE. בשיטה זו החלבונים מופרדים בשדה חשמלי בתנאים דנטורטיביים לפי ההבדלים במסתם. רצועת הג'ל מההרצה הראשונה נטבלת בתמיסה המכילה β-מרקפטואתנול ו-SDS (החפ"ש sodium dodecyl sulfate). התוצאה היא דנטורציה – הרס הקיפול הטבעי של החלבונים והטענתם בצפיפות אחידה של מטען שלילי (שמקורו במולקולת ה- SDS). כעת, החלבונים אינם מקופלים וטעונים בצפיפות מטען זהה. במצב זה הן המטען הכללי על החלבון והן החיכוך המופעל בעת תנועת החלבון בג'ל פרופורציונליים למסת החלבון. לכן, שיטה זו מפרידה את החלבונים על פי מסתם. חלבונים גדולים ינועו לאט יותר בג'ל, לעומת חלבונים קטנים באותו שדה חשמלי.
השדה החשמלי מופעל על הג'ל בזווית 90º, לעומת כיוון השדה של ההרצה הראשונה. התוצאה היא הפרדה נוספת של החלבונים, במימד שני של הג'ל, אנכי למימד הראשון.
רגישות
בתום ההפרדה השנייה החלבונים נמצאים במקומות שונים על גבי הג'ל, כאשר המיקום של כל חלבון בג'ל נקבע על פי הנקודה האיזואלקטרית שלו ועל פי מסתו. כיוון שיש סבירות נמוכה ששני חלבונים שונים זהים גם במסתם וגם במטענם החשמלי, עולה יכולת ההפרדה של השיטה ביחס לשיטות החד ממדיות. כלומר, שיטה זו נחשבת רגישה מאד וניתן להפריד באמצעותה באופן ברור מאות חלבונים על גבי ג'ל אחד.
אבחנה באמצעות צביעה
לאחר ההפרדה ניתן לצבוע את כלל החלבונים בג'ל, צביעה לא ספציפית, בצביעת קומסי בלו (Coomassie blue) או בצביעת כסף (Silver staining). ניתן גם להשתמש בשיטות צביעה ספציפיות יותר, כגון שימוש בנוגדנים ספציפיים.
שכיחות השימוש בהפרדה דו-ממדית
יש לציין כי למרות הרגישות הגבוהה של שיטה זו, השימוש באלקטרופורזה במימד אחד, ובייחוד ב- SDS-PAGE הינו נפוץ יותר, בעיקר משיקולי נוחות העבודה ומידת הצורך ברגישות ההפרדה.
ראו גם
קישורים חיצוניים
23446024אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל