תנועת חלקיק קשור

תנועת חלקיק קשור (באנגלית: TPM‏; Tethered Particle Motion) היא שיטת מחקר ביופיזיקלית השייכת למשפחת חקר המולקולה הבודדת, ומשמשת למדידת מאפיינים שונים של פולימרים כדוגמת DNA או RNA. בנוסף, השיטה מאפשרת למדוד אינטראקציות של המולקולה הנמדדת עם חלבונים שונים, או את השפעת התווך שבו נמצאת המולקולה על תכונותיה.

תנועת חלקיק קשור (TPM). החלקיק נע בדיפוזיה בתוך הנוזל, אך בגלל קשירתו לפולימר הוא יכול לנוע בנפח מוגבל בלבד.

היסטוריה

השיטה הוצגה לראשונה בשנת 1991 על ידי שפר, גלס, שיץ ולנדיק, אשר ערכו מחקר על RNA פולימראז. במחקרם הם קשרו כדורית זהב קטנה לקצה אחד של מולקולת DNA ובנוסף קשרו RNA פולימראז למשטח. בתחילה "תפס" ה-RNA פולימראז את ה-DNA באזור שקרוב לכדורית, אולם בזמן תהליך השעתוק הביולוגי, "החליקה" מולקולת ה-DNA לאורך ה-RNA פולימראז, כך שהמרחק בין הכדורית לבין ה-RNA פולימראז גדל, והכדורית יכלה לנוע באזור נרחב יותר. בעזרת מיקרוסקופ אופטי נמדד גודל האזור שבו נמצאת הכדורית, ומתוך הנתונים הללו חושבה מהירות השעתוק.

מאז בוצעו מחקרים רבים והשיטה שופרה במובנים רבים, בין השאר בסוגי הכדוריות, בשיטות הקשירה הביוכימיות, הצילום שוכלל (מצלמות מהירות יותר ושיטות מיקרוסקופיה משופרות), ואף שיטות ניתוח הנתונים שופרו באופן ניכר.

עקרונות השיטה

סימולציה של תנועת חלקיק קשור - הכדורית הקשורה לפולימר נעה בתנועה בראונית מוגבלת. בעזרת מערכת אופטית עוקבים אחר היטל הכדורית על מישור X-Y (מסומן בנקודות ירוקות) ובניתוח סטטיסטי ניתן ללמוד על מאפייני הפולימר. (הסימולציה נכתבה בתוכנת MATLAB)

את הקצה האחד של המולקולה הנמדדת מצמידים למשטח, ואילו לקצה השני מחברים כדורית זעירה (בקוטר של עשרות עד מאות ננומטרים) שניתן לעקוב אחריה במיקרוסקופ. המולקולה והכדורית נמצאים בתוך סביבה נוזלית, כך שהכדורית נעה בתנועה בראונית, המוגבלת מכיוון שהכדורית קשורה. בעזרת מערכת הכוללת מיקרוסקופ אופטי ומצלמת CCD יוצרים סדרת תמונות המתארות את מיקום הכדורית כפונקציה של הזמן. למרות שהכדורית עצמה יכולה להיות קטנה מגבול הרזולוציה, עדיין ניתן יהיה לראות כתם אור (פונקציית ההרחבה של הנקודה, PSF), אשר מרכזו מתאר את מיקום מרכז הכדורית, ולצורך החישובים גם את קצה הפולימר הנמדד. מכיוון שהקצה השני של הפולימר צמוד למשטח ולפיכך קבוע במקומו, ניתן להתייחס אל המיקום הממוצע של הכדורית כנקודה שבה נמצא הקצה הקשור למשטח, ולכן מיקום הכדורית בכל תמונה מהווה את ההיטל על מישור X-Y של המרחק בין שני קצות הפולימר (end-to-end distance). מניתוח סטטיסטי של מיקום הכדורית במשך הזמן, ניתן ללמוד על מאפייני הפולימר. כדי ללמוד על אופיים של אינטראקציות שונות, מודדים את השינוי במאפייני הפולימר בזמן התרחשות האינטראקציה.

בחירת כדורית מתאימה

על-מנת שתנועת הכדורית תהיה מושפעת בעיקר מהפולימר הנמדד ולא מהדיפוזיה של הכדורית עצמה, צריך לבחור כדורית ברדיוס קטן מספיק, כך שנקבל:

$$\ N_{R}\equiv {\frac {r}{\sqrt {L\cdot \xi /3}}}<1$$

כאשר $\ N_{R}$ הוא פרמטר הנקרא "excursion number", $\ r$ הוא רדיוס הכדורית, $\ L$ הוא אורכו הכולל של הפולימר בזמן שהוא מתוח (contour length), ו-$\ \xi$ הוא אורך ההתמדה (persistence length) של הפולימר (פרמטר המתאר את קשיחותו או את גמישותו של הפולימר. ככל שאורך ההתמדה גדול יותר, כך הפולימר קשיח יותר). עבור מולקולת DNA בתנאים פיזיולוגיים, אורך ההתמדה הוא כ-50 ננומטר.

ניתן לבצע מדידות גם אם $\ N_{R}>1$, אבל אז ניתוח הנתונים מורכב יותר וצריך להיעשות בתשומת לב יתירה.

סוגי כדוריות

תהליך של דעיכת הסיגנל הפלואורוסצנטי בו האות נעלם לאחר מספר דקות (הסרטון מואץ, התהליך נמשך כ-4 דקות).

• כדוריות מתכתיות: הכדוריות המתכתיות (בדרך-כלל מזהב) מפזרות אור בצורה חזקה מאוד, כך שאפילו עבור כדוריות קטנות מאד (בקוטר של כ-40 ננומטר) ניתן לקבל תמונה טובה. חסרונן הוא בכך שהן פחות מתאימות לעבודה עם מלקחיים אופטיים.
• כדוריות פוליסטירן: כדוריות פוליסטירן מפזרות את האור בצורה הרבה פחות יעילה בהשוואה לכדוריות מתכתיות (בשביל לקבל את עוצמת האור המתקבלת מכדורית זהב בקוטר 40 ננומטר דרושה כדורית פוליסטירן בקוטר 125 ננומטר), אולם יתרונן הוא באפשרות לשלב בניסוי גם מלקחיים אופטיות.
• כדוריות פלואורסצנצטיות: היתרון הגדול של כדוריות פלואורוסצנטיות הוא בכך שאורך הגל המעורר שונה מאורך הגל הנפלט, ולכן ניתן להשתמש במסנן דו-צבעי (Dichroic filter) המפריד בין אורכי גל שונים כדי לקבל תמונה נקייה יותר ויחס אות לרעש קטן. חסרונן הוא באיבוד האות לאחר זמן קצר בעקבות דעיכת הסיגנל הפלוארוסצנטי (photobleaching).

כדוריות מכל הסוגים הנזכרים ובגדלים שונים, כולל הציפוי הביוכימי הנדרש לצורך הקשירה, מיוצרות על ידי חברות תעשייתיות שונות וניתן להשיג אותן בקלות יחסית.

הכנת הדגם

לצורך הכנת הדגם צריך תא שקוף (על מנת לאפשר נגישות אופטית) שניתן להזרים לתוכו נוזלים. ישנם תאים כאלה המיוצרים על ידי חברות תעשייתיות, אולם פעמים רבות מכינים את התאים לבד, כדי שיתאימו בצורה האופטימלית לניסוי המתוכנן.

תהליך הכנת הדגם כולל בשלב ראשון פסיבציה של המשטח על-מנת שהמולקולות הנמדדות לא יידבקו אליו. לאחר מכן מזרימים סטרואיד (למשל אנטי-דיגוקסיגנין) שיידבק למשטח. בשלב הבא מזרימים פנימה את המולקולה הנמדדת, כאשר מראש דואגים לכך שמצידה האחד יהיה מחובר הנוגדן המתאים להיקשר לסטרואיד (למשל דיגוקסיגנין, DIG) ולצידה השני מחובר נוגדן או חלבון שיכול להיקשר לכדוריות (בדרך כלל משתמשים בקישור ביוטין - אנטי ביוטין) ולבסוף מזרימים את הכדוריות המצופות בנוגדן או החלבון המתאים.

בין שלב לשלב מבצעים שטיפה של התא על מנת להוציא את שאריות החומרים שלא נקשרו.

ניתוח נתונים

דיסקת איירי.

צילום וידאו מתוך ניסוי TPM. הכדוריות המסומנות בירוק הן כדוריות הקשורות למולקולת DNA, והמולקולות המסומנות באדום מקובעות למשטח.

מציאת מיקום הכדורית (Tracking)

כפי שכבר הוזכר, מיקום מרכז הכדורית מהווה למעשה את ההיטל על מישור X-Y של המרחק בין שתי קצות הפולימר. הכדורית, שבדרך-כלל קטנה מגבול הרזולוציה, תיראה בעקבות פונקציית ההרחבה לנקודה (PSF) ככתם שצורתו דיסקת איירי (ראו תמונה משמאל), אולם מרכז הכדורית נמצא בדיוק במרכז הכתם. מכיוון שהצילום הוא דיגיטלי, התמונה המתקבלת היא לא תמונה רציפה אלא תמונה מפוקסלת, כאשר גודל כל פיקסל הוא בין 6-20 מיקרון (תלוי בסוג המצלמה). מכיוון שאנו רוצים למצוא את המיקום בצורה המדויקת ביותר, לא מספיק להגיד שמרכז הכדורית נמצא בפיקסל המואר בעוצמה החזקה ביותר. ישנן דרכים לחישוב המרכז בצורה מדויקת ונסקור כאן את שתי הדרכים המקובלות ביותר (התוצאות המתקבלות משתי הדרכים כמעט זהות).

התאמה לגאוסיאן דו-ממדי

כפי שהוזכר, צורת כתם האור היא כדיסקת איירי, אשר בקירוב טוב נראית כגאוסיאן דו-ממדי. משוואת הגאוסיאן הדו-ממדי נתונה על ידי:

$$\ G_{2d}(x,y)=A+B\cdot \exp \left[-\left({\frac {(x-x_{0})^{2}}{\sigma _{x}^{2}}}+{\frac {(y-y_{0})^{2}}{\sigma _{y}^{2}}}\right)\right]$$

הפרמטרים $\ x_{0}$ ו-$\ y_{0}$ המחולצים מתוך התאמת התמונה לפונקציית הגאוסיאן הדו-ממדית מהווים את מיקום מרכז הכדורית ברזולוציה של תת-פיקסל.

מרכז מסה

שיטה מקובלת נוספת מבוססת על שיטת חישוב של מרכז מסה, כאשר אנו מחשבים למעשה את מרכז העוצמה של הכתם. מכיוון שלכתם האור יש סימטריה מעגלית, מרכז העוצמה נמצא בדיוק במרכז הכתם. הנוסחא המתארת את מיקום מרכז המסה נתונה על ידי:

$$\ {\vec {R}}_{cm}={\frac {1}{I_{tot}}}\cdot \sum _{i,j}I_{i,j}\cdot {\vec {r}}_{i,j}$$

כאשר $\ I_{tot}$ היא עוצמת האור הכוללת של כל הכתם, $\ i$ ו-$\ j$ הם אינדקסים של הטורים והשורות בתמונה, ו- $\ I_{i,j}$ הוא העוצמה של פיקסל שמרכזו נמצא בקואורדינטה $\ {\vec {r}}_{i,j}$. גם כאן, הדיוק המתקבל במדידה הוא של תת-פיקסל.

התאמת יחידות

המיקום שנמצא בעזרת אחת השיטות שלעיל נתון ביחידות של פיקסלים, ואנו נרצה ל"תרגם" אותו למיקרונים או ננומטרים. לצורך העברת היחידות ישנם שני גדלים שאנו צריכים לדעת: הגדלת המיקרוסקופ $\ M$ (מספר חסר יחידות), וגודל פיקסל במצלמה (יחידות אורך, בדרך-כלל מיקרונים). המיקום ביחידות אורך נתון על ידי:

$$\ R[\mu m]={\frac {{\textrm {pixel\ size}}[\mu m]}{M}}$$

תיקון סחיפה

תיקון סחיפה: בגרף העליון בירוק - הנתונים כפי שנמדדו בניסוי. בשחור - החלקה של הנתונים על-פני חלון זמן גדול.
בגרף התחתון - הנתונים לאחר שהוחסרה מהם פונקציית ההחלקה.

פעמים רבות נוצר מצב שבו כל המערכת זזה בזמן הצילום. ישנן מספר שיטות לתקן את הנתונים הנמדדים כך שתזוזה זאת של המערכת לא תפריע לחישובים, ניתן לחלק את השיטות ל-3 סוגים:

• סינון תדרים: התנועה הבראונית של הכדורית מתבצעת בתדר גבוה בהרבה מסחיפת המערכת, ולכן ניתן להשתמש במסנן מעביר תדרים גבוהים (high-pass filter) שישאיר רק את התנועה של הכדורית. דרך פשוטה ליישום מסנן כזה היא על ידי החלקה של הנתונים הנמדדים על-פני חלון זמן גדול יחסית, ולאחר מכן החסרה של פונקציית ההחלקה מהנתונים (ראו גרפים משמאל).
• מיצוע על מספר כדוריות: אם במהלך הניסוי מצלמים מספר כדוריות, ניתן להניח שמרכז המסה של כל הכדוריות נמצא במיקום קבוע, מכיוון שכל אחת מהכדוריות בפני עצמה עושה תנועה אקראית. אם נחפש את מיקום מרכז המסה כפונקציה של הזמן, נקבל את הסחיפה של המערכת. על ידי החסרה של מיקום מרכז המסה ממיקום כל אחת מהכדוריות, נקבל את תנועת הכדוריות ללא סחיפת המערכת.
• מיקום של כדוריות מקובעות: חלק מהכדוריות המוכנסות לתוך התא במהלך הכנתו, נצמדות למשטח ולא לפולימר הנמדד. אם ניקח את המיקום של כדורית מקובעת כזאת כפונקציה של הזמן, נקבל את סחיפת המערכת. גם כאן נחסר את סחיפת המערכת ממיקום הכדוריות על מנת לקבל את תנועת הכדוריות בלבד.

כמובן שניתן לשלב יותר משיטה אחת על-מנת לקבל דיוק גבוה ככל האפשר.

אפיון הפולימר

כפי שכבר הוזכר, מיקום הכדורית מצביע על המרחק בין שני קצות הפולימר, אותו ניתן לתאר מבחינה סטטיסטית כהולך אקראי. עבור היטל מיקום הכדורית על מימד אחד (ציר X או Y) נקבל התפלגות נורמלית:

$$\ P_{1D}(x)dx={\sqrt {\frac {3}{4{\pi }L\xi }}}\exp {\left(-{\frac {3x^{2}}{4L\xi }}\right)}dx$$

ואילו עבור היטל התנועה על מישור XY נקבל התפלגות ריילי (בקואורדינטות קוטביות):

$$P_{2D}(R)dR=2{\pi }R{\frac {3}{4{\pi }L\xi }}\exp {\left(-{\frac {3R^{2}}{4L\xi }}\right)}dR$$

כאשר $\ L$ הוא ארכו הכולל של הפולימר ו-$\ \xi$ הוא אורך ההתמדה. ניתן להתאים את הנתונים המתקבלים בניסוי לפונקציה המתאימה (חד-ממדית או דו-ממדית) בעזרת פרמטר התאמה יחיד, וכך ניתן למצוא את אורך ההתמדה של הפולימר בהנחה שאורכו הכולל ידוע, או למצוא את אורכו הכולל בהנחה שאורך ההתמדה ידוע. (ישנם מספר שיטות לבצע את ההתאמה לפונקציה, למשל שיטת הריבועים הפחותים.)

קבוע קפיץ

מכיוון שיש יותר מצבים בהם המרחק בין קצות הפולימר הוא קצר (פולימר מקופל) מאשר מצבים בהם המרחק הוא גדול (פולימר מתוח), פועל על הפולימר כח אנטרופי שגורם לו להתנהג כקפיץ. לפי התפלגות בולצמן, ההתפלגות פרופורציונית לאקספוננט של היחס בין האנרגיה האלסטית לבין האנרגיה התרמית:

$$\ P(x)\propto \exp {\left(-{\frac {{\frac {1}{2}}kx^{2}}{K_{B}T}}\right)}$$

כאשר $\ k$ הוא קבוע הקפיץ, $\ K_{B}$ הוא קבוע בולצמן ו-$\ T$ היא הטמפרטורה. על ידי התאמה של לוגריתם של ההתפלגות הנמדדת לפרבולה ניתן למצוא את קבוע הקפיץ של הפולימר:

$$\ k=2{\alpha }K_{B}T$$

כאשר $\ \alpha$ היא המקדם של $\ x^{2}$ שנמצא מתוך ההתאמה לפרבולה.

על-פי התאוריה, קבוע הקפיץ של פולימר נתון על ידי:

$$\ k={\frac {3K_{B}T}{2L\xi }}$$

קל לראות שאין הבדל בין התוצאות המתקבלות על ידי השיטות השונות למציאת מאפייני הפולימר.

יתרונות וחסרונות השיטה

יתרונות

• מערכת זולה ופשוטה יחסית.
• המדידה מתבצעת בסביבה הטבעית של הפולימר, ללא הפעלה של כוחות חיצוניים.
• ניתן לשימוש בשיטות מיקרוסקופיה שונות (מיקרוסקופ שדה אפל, מיקרוסקופ ניגוד מופעים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועוד).
• ניתן לשילוב עם שיטות מחקר שונות, כגון מלקחיים אופטיים או מלקחיים מגנטיים.
• מגוון רחב של אפשרויות מחקר (מדידת מאפייני פולימר, אינטראקציות שונות וכדומה).

חסרונות

• רזולוציה נמוכה יחסית (20~ ננומטר).
• לא מתאים למחקר בתאים חיים (in vivo) אלא למחקרים in vitro בלבד.

קישורים חיצוניים

• קבוצת המחקר של פרופ' יובל גרעיני, המחלקה לפיזיקה והמרכז לננו-טכנולוגיה, אוניברסיטת בר-אילן.
• קבוצת המחקר של פרופ' רוב פיליפס, המכון הטכנולוגי של קליפורניה (Caltech)

הערות שוליים

הערך באדיבות ויקיפדיה העברית, קרדיט,
רשימת התורמים
רישיון cc-by-sa 3.0

24472555תנועת חלקיק קשור