ריצוף בשיטת Ion
ריצוף בשיטת Ion היא שיטה לריצוף DNA המבוססת על זיהוי פרוטון (יון מימן) המשתחרר בזמן פולימריזציית DNA. זוהי שיטה בה הריצוף מתבצע על ידי סינתזה, שבמהלכה הגדיל המשלים נבנה על גבי רצף גדיל המקור.
.jpg)
אל מיקרו-באריות, המכילות גדיל המקרור מ-DNA אותו מעוניינים לרצף, מוזרמים לסירוגין בסיסי DNA - דאוקסיריבונוקלאוטיד פוספט, סוג אחד של חומצת גרעין בכל מחזור פעולה. אם הבסיס המוצג משלים לנוקלאוטיד המוביל בגדיל המקור, הוא מצורף אל הגדיל המשלים המסונתז, תוך כדי פליטת יון מימן, המאותת לחישן יונים וזה מזהה כי התגובה התרחשה. אם ישנן חזרות ברצף המקור, מספר נוקלאוטידים יצורפו במחזור אחד. התרחשות זו תגרור אחריה פליטת יוני מימן בהתאם וכן עליה פרופורציונית בעוצמת האיתות החשמלי.
שיטה זו נבדלת משאר שיטות הריצוף בכך שאינה מצריכה נוקלאוטידים מיוחדים או שימוש באופטיקה. שיטת ריצוף Ion מכונה גם בשמות: ריצוף Ion Torrent, ריצוף באמצעות pH, ריצוף סיליקוני או ריצוף באמצעות מוליכים למחצה (מל"מ).
היסטוריית התפחות הטכנולוגיה
הטכנולוגיה נרשמה על ידי DNA Electronicd Ltd[1][2], פותחה על ידי Ion Torrent Systems Inc ושוחררה בפברואר 2010[3]. Ion Torrent מיתגה את מוצרה כמכונת ריצוף מהירה, קומפקטית וחסכונית, שיכולה לשמש מעבדות רבות.[4]Roshe's 454 Life Sciences משתפת פעולה עם DNA Electronics במאמצים לפתח על בסיס שיטה זו פלטפורמת ריצוף בעלת צפיפות גבוהה (המאפשרת מספר רב יותר של קריאות במקביל) ויכולת קריאת מקטעים ארוכים[5].
טכנולוגיה
כימיית הריצוף
בטבע, צירוף בסיס של חומצת גרעין לתוך גדיל DNA המסונטז מערב יצירת קשר קוולנטי ושחרור של יון מימן טעון חיובית ויון פירופוספט טעון שלילית[6].[1][3]הבסיס יצורף אך ורק אם הוא משלים לנוקלאוטיד הלא מזווג המוביל. שיטת ריצוף Ion מזהה האם נפלט יון מימן בעקבות הזרמת סוג אחד של חומצת גרעין לתוך התגובה.
אל תוך מיקרו- באריות, המכילות העתקים רבים מגדיל אחד של מולקולת DNA העומדת לעבור ריצוף וכן דנ"א פולימרז, מוזרמים לסירוגין בסיסי חומצת גרעין A,C,G או T.[7][8][3] אם הבסיס המוצג הוא הבסיס המשלים לבסיס הלא מזווג הבא בגדיל המקור, הוא מצורף לתוך הגדיל המסונטז על ידי דנ"א פולימרז[9]. אם הבסיס אינו משלים - לא תתרחש תגובה ביוכימית. יון המימן המשוחרר משנה את pH התמיסה ומזוהה על ידי חישן יונים. מולקולות חומצות גרעין אשר לא צורפו לגדיל נשטפות בתום מחזור הפעולה מן הבאריות, ובמחזור פעולה הבא יוצג נוקלאוטיד מסוג שונה[1][3][7].
זיהוי אותות
תחת שכבת מיקרו-באריות ממוקמת שכבה הרגישה ליונים, ותחתיה חישן יונים. כל השכבות מאוגדות בתוך שבב CMOS, כזה שמשתמשים בו בתעשיית האלקטרוניקה[4][10].
כל שבב מכיל מערך של מיקרו-באריות עם חיישני יונים תואמים. כל יון מימן המשוחרר בעת תגובה מגרה את חישן היונים. סדרות של אותות חשמליים מועברים מן הצ'יפ אל המחשב שמתרגם אותם לרצף DNA, ללא צורך בעיבוד נוסף של האות העובר בין החישן לבין המחשב[7][11]. מכיוון שצירופי נוקלאוטידים לתוך הגדיל נמדדים ישירות באמצעות האלקטרוניקה, נמנע שימוש בנוקלאוטידים מסומנים ובמדידות אופטיות[4][10]. עיבוד האות וחישוב הרצף המתקבל מחושבים על ידי תוכנה.
איפיון הריצוף
דיוק החישוב לבסיס כפי שפורסם על ידי Ion Torrent על מכונת ריצוף מסוג Ion Torrent Ion semiconductor בפברואר 2011 היה 99.6% - חישוב המבוסס על קריאות באורך 50 בסיסים עם 100 מגה בסיסים להרצה. דיוק בריצוף של הומופולימר (פולימר המורכב מחזרות של אותה יחידה בסיסית) באורך של 5 חזרות עמד על 98%[12]. גרסאות מאוחרות יותר מציגות קריאות מקטעים בארוך 400 בסיסים[13]. חשוב לציין כי המספרים הללו טרם אומתו מחוץ לחברה.
יתרונות
יתרונה העיקרי של ריצוף בשיטת Ion הוא מהירות הריצוף הגבוהה המושגת בשיטה, ללא צורך בהשקעה גדולה בריאגנטים או בעיבוד האות.[8][11]דבר זה נובע מכך שהשיטה לא עושה שימוש בנוקלאוטידים מסומנים ומדידות אופטיות.
מכיוון שהמערכת מקבלת אותות מאירועי צירוף של נוקלאוטידים באמצעות דנ"א פולימרז המתרחשים בזמן אמת, גם הריצוף יכול להתבצע בזמן אמת. בפועל תדירות הריצוף מוגבלת על ידי מהירות מיחזור הנוקליאוטידים במערכת[14].מפתחת השיטה Ion Torrent Systems Inc טוענת כי מדידת כל אירוע ריצוף מצריכה 4 שניות וכל הרצה לוקחת כשעה, שבמהלכה מרוצפים 100-200 נוקלאוטידים. אם שבבי המל"מ ישתפרו (כפי שחוזה חוק מור), מספר הקריאות לרכיב (ולפי כך להרצה) אמור לעלות[11].
מחיר לצרכן של מכונת ריצוף בשיטה זו בזמן יציאתה לשוק הוערך בכ-50,000$ ארצות הברית, להוציא עלות ציוד להכנת הדגימה ושרת לעיבוד מידע[8][11][15]. עלות להרצה גם היא נמוכה משמעותית מזו של השיטות האחרות לריצוף באמצעות מכונה, וההפרש מוערך בכ-1,000$[8][12].
מגבלות
אם חזרות של אותו הנוקליאוטיד (כגון GGGGG) מופיעות בגדיל המקור (הגדיל המרוצף) אזי יותר נוקלאוטידים המוצגים במחזור של הנוקלאוטיד המשלים הרלוונטי יצורפו לגדיל המסונטז ויותר יונימימן יפלטו במהלך אותו מחזור הפעולה. הדבר גורם לשינוי גדול יותר ב-pH ועליה פרופורציונית בעוצמת האות[11]. עליה זו איננה ליניארית ועל כן קשה יותר לזהות חזרות ארוכות. זוהי מגבלה משותפת לשיטות אחרות המזהות צירוף נוקלאוטיד בודד, כגון שיטת ה-pyrosequencing[16]. אות הנובע ממספר רב של נוקלאוטידים מאותו הסוג קשה להבחנה מול אות אחר הנבוע מחזרה דומה באורכה, ובכך קשה להבחין בין למשל 7 ל-8 מופעים של אותו הבסיס.
מגבלה אחרת של השיטה היא אורך קריאה קצר יותר לעומת שיטות אחרות, כמו ריצוף בשיטת Sanger או pyrosequencing. יכולת קריאת מקטעים ארוכים מהווה יתרון בהרכבת גנום מחדש (שלא מול גנום היחוס). שיטת ריצוף Ion מפיקה בממוצע כ-400 נוקלאוטידים לקריאה[3][8].
נכון לעכשיו תפוקתה של השיטה נמוכה מזו של המובילות המתחרות, אך המפתחים מקווים לשנות זאת על ידי העלאת צפיפות השבב[3].
שימוש
מפתחי שיטת הריצוף Ion מיתגו אותה כשיטת ריצוף מהירה, חסכונית וקומפקטית, שיכולה להיות בשימוש רחב במעבדות. החברה מקווה כי המערכת אותה פיתחה תעביר את מלאכת הריצוף מחוץ למרכזים הייעודיים אל הישג ידם של בתי חולים ומעבדות קטנות יותר[3][4]. בינואר 2011 פורסמה בעיתון New York Times כתבה "ריצוף DNA - לנחלת הכלל" והיא מדגישה שאיפות אלו[17].
מכיוון שהשיטות המתחרות לריצוף DNA מגיעות לאורך קריאה גבוה יותר (ולפי כך מתאימות יותר לריצוף הגנום השלם), הטכנולוגיה הזו יכולה להתאים במיוחד ליישום בסקלות הקטנות, כמו ריצוף גנום מיקרואורגניזמים, תוצרי תעתוק של מיקרואורגניזמים, ריצוף אמפליקון, או כביקורת לספריות גנמיות שנבנו בשיטות אחרות[3][8][18].
קישורים חיצוניים
הערות שוליים
- ^ 1.0 1.1 1.2 DNA Electronics Licenses IP to Ion Torrent, GenomeWeb
- ^ Powering Preventative Medicine - Bio-IT World, www.bio-itworld.com
- ^ 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Nicole Rusk, Torrents of sequence, Nature Methods 8, 2011-01-01, עמ' 44–44 doi: 10.1038/nmeth.f.330
- ^ 4.0 4.1 4.2 4.3 Ion Torrent, www.thermofisher.com
- ^ Roche Partners with DNA Electronics to Help Migrate 454 Platform to Electrochemical Detection, GenomeWeb
- ^ Sunil Purushothaman, Chris Toumazou, Chung-Pei Ou, Protons and single nucleotide polymorphism detection: A simple use for the Ion Sensitive Field Effect Transistor, Sensors and Actuators B: Chemical 114, 2006-04-26, עמ' 964–968 doi: 10.1016/j.snb.2005.06.069
- ^ 7.0 7.1 7.2 Biotechniques - The International Journal for Life Science Method, www.biotechniques.com
- ^ 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 Elizabeth Pennisi, Semiconductors Inspire New Sequencing Technologies, Science 327, 2010-03-05, עמ' 1190–1190 doi: 10.1126/science.327.5970.1190
- ^ Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Molecular Biology of the Cell, 4th, Garland Science, 2002-01-01
- ^ 10.0 10.1 Ion Torrent Patent App Suggests Sequencing Tech Using Chemical-Sensitive Field-Effect Transistors, GenomeWeb
- ^ 11.0 11.1 11.2 11.3 11.4 It’s “Watson Meets Moore” as Ion Torrent Introduces Semiconductor Sequencing - Bio-IT World, www.bio-itworld.com
- ^ 12.0 12.1 At AGBT, Ion Torrent Customers Provide First Feedback; Life Tech Outlines Platform's Growth, GenomeWeb
- ^ https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/Small-Genome-Ecoli-De-Novo-App-Note.pdf
- ^ John Eid, Adrian Fehr, Jeremy Gray, Khai Luong, Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules, Science 323, 2009-01-02, עמ' 133–138 doi: 10.1126/science.1162986
- ^ Ion Torrent Systems Presents $50,000 Electronic Sequencer at AGBT, GenomeWeb
- ^ Michael L. Metzker, Emerging technologies in DNA sequencing, Genome Research 15, 2005-12-01, עמ' 1767–1776 doi: 10.1101/gr.3770505
- ^ Pollack, Andrew (2011-01-04). "Rothberg Seeks to Make DNA Sequencing Common". The New York Times. ISSN 0362-4331. נבדק ב-2016-04-27.
- ^ Simion I. Chiosea, Lindsay Williams, Christopher C. Griffith, Lester D. R. Thompson, Molecular characterization of apocrine salivary duct carcinoma, The American Journal of Surgical Pathology 39, 2015-06-01, עמ' 744–752 doi: 10.1097/PAS.0000000000000410
24407728ריצוף בשיטת Ion