מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני
מיקרוסקופ אלקטרונים בטמפרטורות נמוכות או מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (Cryo-EM) הוא מיקרוסקופ אלקטרונים המאפשר שיקוף ומדידת גדלים אופייניים של מולקולות מורכבות, כמו חלבונים ופחמימות בתוך תמיסה. שיטה זו אפשרה לראשונה שיקוף של חומרים ביולוגיים רגישים לקרינה בסביבה הטבעית שלהם. השיטה מתבססת על העובדה שקרח זגוגי (Vitrous ice), המושג באמצעות קירור מהיר (Super cooling) של מים, יכול להיווצר בתצורה לא גבישית. שימוש בתמיסה מוקפאת מעין זו, מאפשר שיקוף של החומר במיקרוסקופ אלקטרונים ללא אפקט פיזור גבוה הנוצר בקרח גבישי. לשיקוף החומר בתמיסה חשיבות רבה, בשל התלות של מאפייני החומר ובייחוד המבנה שלו בקיומה של התמיסה ובהרכבה. כתוצאה מכך, מבנה חומרים ביולוגיים בסביבת ואקום שונה בתכלית מהמבנה שלהם בסביבתם הטבעית (אין ויוו).
השיטה הוצגה לראשונה ב-1974 על ידי קן טיילור (Ken Taylor) ורוברט גלאסר (Robert Glaeser) שהוכיחו כי ניתן לשמר מבנה של חלבונים בתוך קרח זגוגי[1]. בראשיתה, השיטה לא היוותה תחרות אמיתית לשיטות המקובלות כמו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, בשל רזולוציה נמוכה. עם השנים התפתחה השיטה והרזולוציה עלתה בהדרגתיות, כשב-2014 הושגה באמצעות השיטה רזולוציה כמעט אטומית (4.5 Å) שאיפשרה להציג את צורתם של ריבוזומים[2] ושל מיטוכונדריה.[3]
התפתחות השיטה
השיטה התפתחה על רקע שתי בעיות מרכזיות בשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים. הבעיה הראשונה נובעת מכך שהאנרגיה של אלומת האלקטרונים (בסדר גודל של מאות KeV) גבוהה בכמה סדרי גודל מהאינטראקציות הפועלות בין המולקולות ולפיכך מסוגלת לפרק אותם ולגרום לפגיעה בחומר ובמבנה שלו. עובדה זו הופכת את האפשרות לשקף חומרים ביולוגיים במיקרוסקופ אלקטרונים לקשה עד בלתי אפשרית. הבעיה השנייה טמונה בכך שדוגמה הנמצאת במיקרוסקופ אלקטרונים מצויה בוואקום ובנוסף עליה להיות דקה במיוחד בגלל האינטראקציה החזקה של החומר עם אלומת האלקטרונים. לכן, החומר לא יכול להימצא בתמיסה מימית בזמן הבדיקה (אם החומר יימצא בסביבה מימית, המים יתאיידו בשל רמת הוואקום הגבוהה ויחס שטח פנים-נפח גדול). אילוץ זה מהווה בעיה מרכזית בניסויים מולקולות ביולוגיות ותאים חיים, שמאפייניהם וצורתם משתנים באופן קיצוני כשהם מצויים מחוץ לתמיסה[4].
אחת השיטות הראשונות שהוצעו לפתרון בעיית הרס החומר הנבדק על ידי אלומת האלקטרונים נקראת Negative stains[5]. בשיטה זו החומר מצופה בשכבת שרף בעל עמידות גבוהה לאינטראקציות חשמליות חזקות. באופן זה, החומר מוגן מצד אחד על ידי השרף, ומצד שני, פיזור האלקטרונים מהשרף הדבוק לאטומי או מולקולות החומר מאפשר לקבל תמונה טובה יחסית של צורתם החיצונית. עם זאת, ציפוי החומרים הביא לפיזור לא אחיד של השרף על פני השטח ולשגיאות במדידה. בנוסף, שיטה זו עדיין לא איפשרה לבצע דיאגנוסטיקה של החומר בסביבתו הטבעית.
כדי למנוע את התאיידות המים בתמיסה, ניתן להכניס את החומר בתמיסה שהוקפאה לתוך המיקרוסקופ. עם זאת, כיוון שקרח בתצורתו הרגילה הוא גבישי, הדיפראקציה האלקטרונית מהקרח תהיה מאד חזקה ולא תאפשר לקבל תמונה של החומר המצוי בתמיסה הקפואה. בתחילת שנות ה-70 בוצע הצעד הראשון לקראת פתרון הבעיה. קבוצות של פיזיקאים החלו במחקר השיטות השונות לקירור מהיר של מים (Super-cooling). הם גילו, כי בצורה זו, של קירור מהיר, ניתן לקבל קרח בתצורה לא גבישית. ממצא זה אפשרה לקבוצת סטודנטים ב-"מעבדה לביולוגיה מולקולרית האירופאית" להשתמש ב-Cryo-EM הראשון, ולהציג לראשונה תמונה של חומר בסביבתו הטבעית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. בשלב זה הושגה רזולוציה של עשרות אנגסטרום בלבד, שלא יכלה להתחרות ברזולוציה שהתאפשרה בשיטת הקריסטלוגרפיה באמצעות קרני X. עם השנים השיטה השתכללה ובוצע שימוש בציוד עם דיוק גבוה יותר שאיפשר השגת רזולוציה של אנגסטרומים בודדים.
אופן הפעולה
מיקרוסקופ אלקטרונים בטמפרטורות נמוכות דומה במבנהו למיקרוסקופ אלקטרונים חודר: מקור אלקטרונים (קתודה פולטת אלקטרונים) שולח אלומת אלקטרונים; האלומה ממוקדת באמצעות סט עדשות אלקטרומגנטיות, שהן למעשה סט של מספר סלילים היוצרים שדה מגנטי שממקד את אלומת האלקטרונים לעבר דוגמה; הדוגמה, המצויה בתווך של קרח זגוגי, מקוררת לפני הניסוי על ידי קירור מהיר (Super-cooling) ונשמרת במהלך הניסוי בתוך חנקן או אתאן נוזלי, המצוי בטמפרטורות קריוגניות. בכך, הקרח הזגוגי שומר על מבנהו בפאזת מוצק לא מסודר. בנוסף, הטמפרטורה הנמוכה של החומר מאפשרת לשמור עליו מפני נזקי האינטראקציה עם האלקטרונים. אלומת האלקטרונים מפוזרת על ידי החומר ומרוכזת שנית על ידי סט עדשות אלקטרומגנטיות ונקלטת על פני גלאי אלקטרונים הממיר אותם לפוטונים לקבלת תמונה[6].
בשל הרגישות של החומרים הביולוגיים לקרינה, אלומת האלקטרונים היא קצרה בזמן ומוגבלת באנרגיה שלה. בשל כך, מתקבלת תמונה עם ניגודיות נמוכה. לפתרון בעיה זו מבצעים מיצוע על פני האובייקטים הנמדדים בחומר, לקבלת תמונה חדה יותר.
סוגים שונים של מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני
בדומה למיקרוסקופ אלקטרונים, ישנם סוגים שונים של מיקרוסקופ אלקטרוני קריוגני המאפשרים קבלת תוצאות שונות בהתאם לצורכי המדידה:
- מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני סורק
- מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני טומוגרפי
ראו גם
קישורים חיצוניים
- מידע על המיקרוסקופ, באתר nature
- elife (הקישור אינו פעיל, 29 באוגוסט 2018)
הערות שוליים
- ^ Taylor, K.A. & Glaeser, 186 1036–1037 (1974, R.M. Science
- ^ Wong et al., Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine, eLife
- ^ Amunts et al, Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit, Science
- ^ gatan, Cryo-EM, gatan
- ^ DeRosier, D. J. & Klug, Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs, Nature 217
- ^ Jacqueline L. S. Milne,1 Mario J. Borgnia,1 Alberto Bartesaghi,1 Erin E. H. Tran,1 Lesley A. Earl,1 David M. Schauder,1 Jeffrey Lengyel,2 Jason Pierson,2 Ardan Patwardhan,3 and Sriram Subramaniam, Cryo-electron microscopy: A primer for the non-microscopist, NCBI - PMC, 2014 Jan 1
