הרכבת גיבסון

הרכבת גיבסון היא שיטה להרכבת מקטעי DNA, המאפשרת חיבור של מספר מקטעי DNA בתגובה איזותרמית אחת. השיטה פותחה בשנת 2009 על ידי דניאל גיבסון, בעת שעבד במכון ג'יי. קרייג ונטר (JCVI).

השיטה

הרכבת גיבסון מיועדת לחיבור מספר מקטעי DNA, בהתבסס על זהות רצפית. לצורך כך נעשה שימוש במקטעי DNA החופפים ביניהם בכ-20-40 זוגות בסיסים. אל מקטעי ה-DNA מוסיפים תערובת של שלושה אנזימים בתוך תמסית בופר מתאימה, ומדגירים בטמפרטורה של 50°C למשך שעה.

בבסיס השיטה עומדת פעילותם של שלושה אנזימים:

אקסונוקלאז T5
DNA פולימראז עמיד בחום (דוגמת פולימראז Phusion)
Taq DNA ליגאז

פעילות האקסונוקלאז מביאה לפירוק של גדיל DNA יחיד מכיוון קצה '5. בעקבות זאת, מקטעי DNA חופפים נצמדים זה לזה (עוברים היברידיזציה). כעת פעילות הפולימראז משלימה את הפער הקיים במולקולת התוצר באמצעות הוספת נוקלאוטידים. לבסוף, פעילות הליגאז מביאה לחיבור של מקטעי DNA סמוכים, ומתקבלת מולקולת DNA מאוחה ורצופה.

ניתן לבצע טרנספורמציה של התוצר לחיידקי E. coli ולהפיק מהם את מקטעי ה-DNA.